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熒光定量PCR儀如何選擇?

2019-12-11瀏覽量:271編輯:來源:

實時熒光定量pcr儀,由熒光定量系統和計算機組成,用來監測循環過程的熒光。與實時設備相連的計算機收集熒光數據。數據通過開發的實時分析軟件以圖表的形式顯示。原始數據被繪制成熒光強度相對于循環數的圖表。原始數據收集后可以開始分析。實時設備的軟件能使收集到的數據進行正常化處理來彌補背景熒光的差異。正常化后可以設定域值水平,這就是分析熒光數據的水平。

朗基熒光定量PCR儀


那如何選擇熒光定量PCR儀器呢,可以從以下幾個方面著手:

1、儀器使用的廣泛程度

  如果不是一個新出現的儀器品牌,為保證所購置的儀器有充分的可靠性,臨床PCR實驗室可以從相應儀器在國內外使用的廣泛程度來判斷。應用越是廣泛的儀器,越是經過實踐驗證的,也就越具有可靠性。
2、儀器的檢測通量(反應孔數)
  在購買定量PCR儀的時候需要根據實驗室的要求來選擇不同通量的儀器。目前市面上的熒光定量PCR儀的檢測通量小到16多到384孔,實驗室可以根據自己的檢測項目和發展狀況,選擇合適的儀器,沒必要追求最昂貴的儀器,一般來說,96孔的通量足夠用了;如需尋找新藥靶點和疾病標記等類型的實驗,則可以考慮購買384孔的儀器。
3、儀器的通道數量
  隨著醫院開展的項目越來越多,比如基因表達,單核苷酸多態性分析、高分辨率熔解曲線等,那么單通道的儀器則無法滿足實驗室的需求了,而多通道的設計則能使其更方便地檢測多重PCR檢測及其衍生的基因表達等其他分析模式。
4、耗材的開放性
  耗材如擴增反應管的開放性可能會決定日常檢測成本的高低。作為臨床PCR實驗室,在選擇實時熒光PCR儀時,可考慮這一點。不過對于檢測HCV等RNA項目的時候,盡量使用去RNAnase酶耗材。
5、硬件設計特點
  熒光定量PCR儀主要有96孔板式和離心式等,每種設計都有它的獨到之處,但也都有無法避免的缺陷。
  96孔板的熒光定量PCR儀可以容納的樣本量大,最大可至100ul,而且無需特殊的耗材。傳統的96孔板儀器多采用鹵鎢燈激發、CCD檢測。其優點在于:鹵鎢燈的光強比LED燈強,波長范圍廣,對于熒光染料的激發具有非常好的效果,性能比較穩定,使用壽命約3000個小時左右;但CCD的檢測通常會因為每個樣品孔距光源和檢測器的光程各不相同,會產生邊緣效應,對結果產生一定的影響。為了保證精確、精準的實驗結果,這類儀器在實驗過程中通常需要配合ROX校正染料,來平衡孔間差異;
離心式的儀器通常選用LED激發、PMT檢測,設計上避免了邊緣效應,同時PMT檢測對熒光信號可以放大或縮小,相對于CCD檢測更加靈活,靈敏度更高;但LED的熒光強度比較弱,波長范圍也比較窄,因此,對熒光染料的激發效果不如鹵鎢燈;
6、運行速度
  在熒光定量PCR儀的眾多技術參數中,升降溫速度也是非常重要的。更快的升降溫,可以縮短反應進行的時間,而且縮短了可能的非特異性結合和反應時間,提高PCR的特異性。但是,運行速度越快,對加熱制冷模塊的要求越高,因此,穩定性是其存在的最大問題,如果在市面上經過長期考證的,穩定性好的儀器,運行速度越快,帶來的便捷越多;
7、靈活性

  在儀器基本性能得到保證的情況下,另外一方面則需要考慮儀器的靈活性,主要包括:儀器運輸的靈活性,拆卸的靈活性,軟件升級的靈活性,模塊更換的靈活性以及使用的靈活性等。



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